Ji hêla Peter Sarnow ve hatî guherandin, Dibistana Dermanê ya Zanîngeha Stanford, Zanîngeha Stanford, California, di 25ê Kanûna Pêşiyê, 2020-an de hate pejirandin (di 25ê Cotmeha 2020-an de hate nihêrtin)
Em pêwendiya di navbera yekîneyan de di dubarekirina kompleksên coronaviruses-transkripsiyonê de, ku ji bo dubarekirin û parastina pêşkeftinê bingehîn in, radigihînin.Me delîl peyda kir ku qada NiRAN ya ku bi nsp12 ve girêdayî ye di trans de çalakiya transferaza nukleozîd monophosphate (NMP) heye, û nsp9 (proteînek girêdana RNA) wekî hedefa wê nas kir.NiRAN di reaksiyonekê de ku xwe dispêre îyonên Mn2+ û bermahiyên Asn-ê yên parastî yên cîran, girêdana kovalentî ya beşa NMP-ê bi dawiya amînî ya nsp9-a parastî re katalîz dike.Hat dîtin ku çalakiya NiRAN û nsp9 NMPylation ji bo dubarekirina coronavirus pêdivî ye.Daneyên rê dide me ku em vê çalakiya nîşankera enzîma vîrusê ya hêlîn bi çavdêriyên berê yên di hîpoteza ku destpêkirina senteza RNA di çînek vîrusên RNA de ji hêla fonksiyonel û pêşkeftinê ve hevgirtî ye ve girêbidin.
RNA-polîmeraza girêdayî RNA (RdRps) ya Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, û 12 malbatên din) bi qada amino-termînalê (N-termînalê) ve di proteîna ne-avahî (nsp) de ku ji polîproteînê derdikeve, bi navê NiRAN ve girêdayî ye. 1ab ji proteaza sereke ya vîrus (Mpro) pêk tê.Berê, çalakiya xweya GMPylation/UMPylation ya vîrusa arterial NiRAN-RdRp nsp hate ragihandin, û hate pêşniyar kirin ku ji bo veguheztina monophosphate nukleozîd (NMP) berbi vîrusê (niha nenas) û / an Tiştên biyopolîmerkirina hucreyê veguhezek çêbike.Li vir, em destnîşan dikin ku koronavirus (Coronavirus Mirovan [HCoV]-229E û Sendroma Bêhnvedanê ya Zehmetî ya Giran Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) xwedan çalakiya NMPylation ya girêdayî Mn2+ ye, ku ji nsp9 bi avakirina nsp9-ya Mpro-navbeynkar ve tête peyda kirin. nsps-ya N-termînalê bi proteolîtîk tê berdan, fosforamîdat bi amîna seretayî (N3825) li N-termînala nsp9 ve tê girêdan.Uridine triphosphate di vê reaksiyonê de nukleotîdê bijarte ye, lê adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, û cytidine triphosphate jî hev-substrat in.Lêkolînên mutasyonê bi karanîna proteînên nsp9 û nsp12 yên rekombînant ên coronavirus û mutantên HCoV-229E bi endezyariya genetîkî ve bermahiyên ku ji bo nsp9 NMPylation bi navbeynkariya NiRAN û vejandina vîrusê di çanda hucreyê de hewce ne diyar kirin.Daneyan pêşbîniya bermahiyên malpera çalak a NiRAN piştrast kir û rola girîng a bermahiyên nsp9 N3826 di nsp9 NMPylation û dubarekirina vîrusê de di vitro de destnîşan kir.Ev bermayî beşek ji rêzika sêpeptîda NNE-ya termînala parastî ye û îsbat kir ku di malbata coronavirus de tenê bermayiya guhêrbar a nsp9 û homologên wê ye.Ev lêkolîn ji bo lêkolîna fonksiyonel a çalakiya NMPylation ya vîrusên din ên hêlîn bingehek zexm peyda dike û ji bo pêşkeftina dermanên antiviral armancên mimkun pêşniyar dike.
Vîrûsa RNA-ya pozîtîf a Nidovirales cûrbecûr vertebrîtan û bêvertebrîtan vedigire (1, 2).Ferman niha 14 malbat (3) dihewîne, ku ji wan malbata Coronavirus di 20 salên borî de bi berfirehî hatî lêkolîn kirin.Di wê demê de, sê coronavirusên zoonotîk ji mêvandarên heywanan derketin û bûn sedema derketinên mezin ên enfeksiyonên giran ên tansiyonê di mirovan de.Di nav de pandemiyên domdar ên ku ji ber nexweşiyên giran ên infeksiyonê yên akût têne çêkirin.Sendroma Respiratory Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).Nîdovîrûs rêxistinek genomê ya hevpar parve dikin, û jêr-yekeya kompleksa veguhez-transkripsiyonê ya bi membranê ve girêdayî (RTC) di du-sêyan termînala 5-?²-termînal û bineyekeya avahîsaziya sereke ya parça vîrusê de, û her weha hin aksesûar têne kod kirin. .Proteîn, di 3??² dawiya sêyemîn a genomê (1) de tê kodkirin.Ji xeynî yek malbatek vîrusên planerî (Monoviridae) (8), hemî vîrusên hêlînkirî di du çarçoveyên xwendinê yên vekirî yên mezin (ORF) ORF1a û ORF1b de, ku ji ARN-ya genomîk ve têne wergerandin, binyekeyên RTC kod dikin.ORF1a polyprotein (pp) 1a kod dike, û ORF1a û ORF1b bi hev re pp1ab kod dike.Bi tevlêbûna giştî ya proteaza sereke (Mpro) ku ji hêla ORF1a ve hatî şîfrekirin, hem pp1a û hem jî pp1ab bi proteolîtîk di nav cûrbecûr proteînên ne-avahîsaz (nsps), ku wekî 3CLpro jî tê zanîn, têne hilberandin, ji ber ku ew bi 3Cpro ya picornavirus re homologî ye ( 9).Tê fikirîn ku ev nsps di RTCyek dînamîkî ya mezin de têne berhev kirin, senteza ARNya genomîk (berbiçav) û komek RNA-ya jêrgenomîk (transkrîpsîyon) katalîz dikin, û ji bo koordînasyona îfadeya ORF-a ku li jêrzemîna ORF1b ye têne bikar anîn (10? ? ?12).
RTC-ya bingehîn RNA polîmeraza girêdayî RNA (RdRp) (13), supermalbata 1 helîkaze (HEL1) (14, 15) û çend enzîmên hilberîna RNA-yê vedihewîne, ku bi giranî di ORF1b û di malbata coronavirus de têne kod kirin. Ew nsp12-nsp16 û nsp9-nsp12 di malbata Arterioviridae de (binêre referansa 10ââ 12).RdRp û HEL1 du (yek ji pêncan) domên parastî yên vîrusa hêlîna çûkan temsîl dikin û di nav vîrusên RNA yên din de xwedî homologî ne.Tê bawer kirin ku replicase-ya bingehîn ji hêla yekîneyên din ve tê arîkar kirin, di nav de çend nsps-yên piçûk ên ku ji herêma karboksî-termînalê (C-termînala) ya pp1a, jêrzemîna Mpro-yê (bi rêzê ve, nsp5 û vîrusa arterialî nsp4) têne berdan.Ew parastina taybet-malbatê û çalakiyên cihêreng sînordar in (di referansa 10ââ12 de hatine vekolîn).
Di van demên dawî de, domanek bi taybetmendiyên motîfa rêzikên bêhempa li dawiya amînî (N-terminus) li tenişta RdRp di hemî vîrusên hêlîn de hate dîtin, lê ti vîrusên RNA yên din tune (16).Li ser bingeha cîh û çalakiya wê ya nukleotîd transferaza (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), navê vê domainê NiRAN (Nestvirus RdRp-related nukleotide transferase) ye.Kombînasyona du-domînayê ya NiRAN-RdRp nsp12 di malbata Coronaviridae û nsp9 di malbata Arterioviridae de pêk tîne, û di nestoviridae yên din de, tê çaverê kirin ku NiRAN-RdRp wekî nspek serbixwe ji polîproteîna vîrus were berdan.Di coronavirus de, domaina NiRAN ??1/450 bermayiyan dihewîne û bi navgîniya devera girêdanê (16?19) bi qada RdRp ya C-termînalê ve girêdayî ye.Di Vîrûsa Arteritisê ya Hespan de (EAV) (Arteriviridae), nsp9-ya rekombînant çalakiyên UMPylation û GMPylation-girêdayî Mn2+-îyon-girêdayî (xwe) nîşan dide, ku bi sê bingehên rêzikên parastî yên di nestovirus, AN, BN û CN de bermayiyên di rêzê de ve girêdayî ne.Cihê ku N ji bo NiRAN radiweste) (16).Alavên N-termînala van motîfan motîfek kêmtir muhafezekar preAN e.Hin ji van bermayiyan di heman demê de proteîn kinasesên dûr ve girêdayî têne parastin, li ku derê hatine destnîşan kirin ku ew di girêdana nucleoside triphosphate (NTP) û çalakiya katalîtîk de beşdar dibin (20, 21).Li gorî vê çavdêriyê, çend bermahiyên cîhê çalak ên sereke yên di pseudokinase SelO ji Pseudomonas syringae de dikarin bi superkompleksa SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ya nû hatî weşandin werin berhev kirin.Bermahiyên Coronavirus NiRAN yên parastî di mîkrostruktura elektronîkî de têne hilanîn.Proteîna rekombînant (17).Tê texmîn kirin ku U/GMPylation-ya belgekirî (xwe) dê rewşek demkî çêbike da ku NMP veguhezîne substratê (niha nenas) (16), û wekheviya strukturî ya di navbera NiRAN û proteîn kinase (17, 19) de ev hîpotez e ku NiRAN proteînên din diguherîne.
Gelek taybetmendî, di nav de pêwendiya wê ya sîstematîkî ya bêhempa û bêhempa ya bi vîrusên hêlînkirî û veqetandina genetîkî ji RdRp, NiRAN dike enzîmek birêkûpêk a bingehîn a maqûl ji bo vîrusên hêlîn, ku ji derketin û nasnameya wan re krîtîk e.Berê, sê fonksiyonên mimkun ên ku bi NiRAN ve girêdayî ye ku ji bo sererastkirina genom / wergera subgenomîk an dubarekirin / veguheztin tê gotin.Dema ku daneyên kêm û netemam ên di wê demê de berdest têne hesibandin, her fonksiyonek xwedan avantaj û dezawantajên xwe hene (16).Di vê lêkolînê de, em armanc dikin ku lêkolînên genetîkî yên biyokîmyayî û berevajî yên coronavirusên ku her du cins temsîl dikin bikin yek, û vedîtinên xwe di paşxaneya pêşkeftinê ya mutasyona xwezayî ya malbata coronavirus de bixin nav hev, da ku em li ser vê qada Mysterious têgihiştinê bistînin.Em pêşkeftinên mezin di têgihiştina NiRAN-ê de bi navgîniya nasîna armancên xwezayî li RTC-yê radigihînin, ku (di nav sê hîpotezên berdest de) beşdarî rola vê domainê di destpêkirina senteza RNA ya vîrusê ya hêl de dibe.Ev lêkolîn di heman demê de ji bo rolên din ên NiRAN li ser navgîniya mêvandarê vîrusê jî îmkanan vedike.
Ji bo ku em taybetmendiyên enzîmatîk ên vîrusa koronayê nsp12-a domana NiRAN-ê ya girêdayî nsp12-ê diyar bikin, me rengek ji nû vekombînant a koronavirusê ya mirovî 229E (HCoV-229E) nsp12 li E. coli, bi nîşanek His6 li dawiya C-yê hilberand, û proteîna bi [α32-P] bi NTP re li ber hebûna MnCl2 wekî ku di Materyal û Rêbazan de hatî destnîşan kirin bi hev re înkub bikin.Analîzkirina hilbera reaksiyonê hebûna proteînek nîşankirî ya bi nsp12 (106 kDa) destnîşan kir, ku destnîşan dike ku coronavirus nsp12 avakirina proteîn-NMP-yên kovalentî, ku bi tercîhî bi uridine monophosphate (UMP) ve hatî çêkirin, katalîze dike (Wêne 1A) Û B).Analîzên hêjmarî destnîşan kir ku li gorî nukleotîdên din, tundiya nîşana tevlêbûna UMP-ê 2-3 carî zêde bû (Wêne 1C).Ev dane bi çalakiya pêşbînîkirî ya NMP transferase ya qada NiRAN ya coronavirus (16) re hevaheng e, lê destnîşan dike ku tercîhên nukleotide yên domaina NiRAN ya coronavirus û vîrusa arterialî cûda ne.
Çalakiya Xwe-NMPylasyonê ya HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) bi [α-32P] NTP-ya destnîşankirî li ber hebûna 6 mM MnCl2 ji bo 30 hûrdeman hate înkubakirin (ji bo hûragahiyan li Materyal û Rêbaz binêre).Berhemên reaksiyonê ji hêla SDS-PAGE ve hatin veqetandin û bi Coomassie şîn a şîn hatin reng kirin.(B) Proteîna nîşankirî ya radyoyî bi wênekirina fosforê tê xuyang kirin.Helwestên nîşankerên girseya molekulê ya nsp12-His6 û proteînê (bi kilodaltonan) di A û B de têne xuyang kirin. (C) Zêdebûna sînyala radyoaktîf (navgîn ± SEM) ji sê ceribandinên serbixwe hate destnîşankirin.*P≤0.05.Hêza sînyala (ji sedî) bi UTP ve girêdayî ye.
Her çend çalakiyên enzîmê yên bi NiRAN-ê ve hatine destnîşan kirin ku ji bo dubarekirina EAV û SARS-CoV di çanda hucreyê de bingehîn in (16), fonksiyona taybetî ya NiRAN û armancên potansiyel hîn nehatine destnîşankirin.Di van demên dawî de wekheviya avahîsaziyê ya di navbera NiRAN û malbatek proteînan de bi pêlên mîna proteîn-kînaze (17, 22) ve hatî ragihandin, me teşwîq kir ku em hîpoteza ceribandinê bikin ku NiRAN NMPylasyona proteînên din katalîze dike.Me komek armancên homolog ên potansiyel hilberand, di nav de proteînên ne-avahî yên ku ji hêla HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) ve hatine kodkirin, her yek tê de nîşanek His6-ya termînala C-yê heye (pêveka SI, Tablo S1), û van proteînan bi [α32-P] ûrîdîn trifosfat ([α32-P]UTP) di hebûn an tunebûna nsp12 de înkube bikin.Albumîna seruma bovine û proteîna fusionê ya MBP-LacZα ku di E. coli de hatî hilberandin wekî kontrolê xizmet dikin (Wêne 2A, rêçikên 1 heta 7).Proteîna radîyoaktîf bi elektroforeza gel a sodyûm dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) û otoradiyografî hate analîz kirin û hate dîtin ku di reaksiyona ku nsp12 û nsp9 tê de îşaretek radyoaktîf a xurt heye.Helwesta sînyalê bi girseya molekulê ya nsp9 re têkildar e, ku nsp12-navbeynkariya UMPylation ya nsp9 nîşan dide (Wêne 2B, rêça 7).Ti proteînên din ên ceribandinê nehatin dîtin ku UMPylated in, ku me hişt ku em vê encamê bigirin ku nsp9 substratek taybetî ya nsp12 e.Li gorî daneyên xwe-NMPylasyonê ku di Figure 1-ê de têne xuyang kirin, nsp12 dikare her çar NMP-yan veguhezîne nsp9, her çend karîgerî cûda ye, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP)) Sûret).3 A û B).Di bin şert û mercên ku di vê ceribandinê de têne bikar anîn (kurtkirina dema reaksiyonê û vegirtinê, kêmkirina giraniya nsp12; materyal û rêbaz), xwe-NMPylasyona nsp12 nekare were tespît kirin (Berhev bikin Figure 2B, lane 7, and Figure 1B), ku bandorkerek îsbat kir (Û gelek geryan) UMP ji nsp12 ber bi nsp9 ve çû.Çalakiya transferaza UMP hebûna îyonên Mn2+ hewce dike, wekî ku di Figure 3C de tê xuyang kirin, di heman demê de ku di hebûna Mg2+ de tenê çalakiya transferaza UMP ya hindiktirîn hate dîtin, û di hebûna du kationên din ên duvalent ên ku hatine ceribandin de çalakî tune.Daneyên bi vî rengî di ceribandinên NMPylation de ku di nav wan de cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP) û adenosine triphosphate (ATP) hene (SI pêvek, Figure S1) hatin bidestxistin.
HCoV-229E nsp12-UMPylation of nsp9.Ji bo nirxandina çalakiya UMPylation ya HCoV-229E nsp12-His6⁺-navdêr, rêzek substratên proteîn (di nav de albûmîna seruma gayê, MBP-lacZα, û rêzek HCoV-229E nsps-ên bi C-termînala His6-ya ku ji hêla ORF1a ve hatî şîfrekirin tê de) tê bikar anîn. proteîn.Di nebûna (A) an hebûna (B) ya nsp12 de wekî ku di materyal û rêbazan de hatî destnîşan kirin proteîn bi [α-32P] UTP 10 hûrdeman înkub bikin.Li jora A û B, gêla SDS-polyacrylamide ku bi Coomassie Brilliant Blue hatî xêzkirin tê xuyang kirin, û li binê A û B, otoradiogramên têkildar têne xuyang kirin.Cihê nîşana girseya molekulê ya proteîn (bi kilodalton) li milê çepê tê dayîn.Helwesta nsp12-His6 (B, top) û sînyala radyoaktîf ku di dema înkubasyona nsp12-His6 de bi nsp9-His6 (B, rê 7) ve hatî dîtin jî têne destnîşan kirin, ku destnîşan dike ku [α-32P]UMP heya nsp9-His6 (12.9 kDa), ku ji bo proteînên din ên ceribandin nehatin dîtin.
HCoV-229E NîRAN-navbeynkariya biyolojîk û vîrusê taybetmendiya nsp9 NMPylation.(A û B) Rola hev-substratê ya nukleotidê ku di reaksiyonê de tê bikaranîn.Nsp12-His6 û nsp9-His6 bi hebûna [α-32P] NTP-ên cihêreng di ceribandina NMPylation standard de têne tevlihev kirin û inkubasyon.(A, jor) nsp9-His6-rengkirî ya Coomassie ji hêla SDS-PAGE ve hatî veqetandin.(A, jêrîn) Autoradiografiya heman devera gêlê.(B) Çalakiya têkildar (navgîn ± SEM) di hebûna kofaktora nukleotîdê ya destnîşankirî de ji sê ceribandinên serbixwe tê destnîşankirin.*P≤0.05.(C) Rola îyonên metal.Di hebûna [α-32P] UTP û îyonên metal ên cihêreng de, her yek bi giraniya 1 mM, testa NMPylation standard tê destnîşan kirin.Di C de, jor, Coomassie nsp9-His6 rengkirî tê xuyang kirin, û di C de, jêrîn, otoradiografiya têkildar tê xuyang kirin.Mezinahiya proteîna nîşankirî (bi kilodaltonan) li çepê A û C tê xuyang kirin. (D) Forma mutant a HCoV-229E nsp12-His6 ku veguheztina asîda amînî ya diyarkirî hildigire di [α-32P]UTP de ye, wekî ku hatî diyar kirin. li Materyal û Rêbaz.nsp9-His6-a radîyolabelkirî ya ku di reaksiyona NMPylation de hatî hilberandin bi wênekirina fosforîlasyonê (D, top) tê kifş kirin.Çalakiya têkildar bi proteîna çolê (wt) re li D-yê tê xuyang kirin, û jêrîn wekî navîn (±SEM) ji sê ceribandinên Serbixwe tê girtin.Stêrk cîgirkirina bermahiyên ne-parastî nîşan dide.(E) Tîtra vîrusê ya di supernatantê çandê ya hucreyên p1 de ku 24 demjimêran piştî enfeksiyonê hatî wergirtin bi ceribandina plakê hate destnîşankirin.Veguheztinên kodonê yên li qada NiRAN ya mutantê HCoV-229E-ya endezyarkirî têne destnîşan kirin (hejmarkirina bermayî li gorî pozîsyona wan di pp1ab de ye).Mutanta malpera çalak a RdRp-kêmasî-kêmasî nsp12_DD4823/4AA wekî kontrolek hate bikar anîn.
Ji bo ku em têgihîştinek kûr a malpera çalak a NiRAN bi dest bixin û bermahiyên têkildarî çalakiya NMP-transferase ya nsp9-taybetî diyar bikin, me analîza mutasyonê pêk anî, ku tê de me bermahiyên muhafezekar ên di motîfên NiRAN AN, BN û CN de cîh girtin ( 16) Ala ye (pêveka SI, Figure S2).Wekî din, bandora veguheztinên Arg-to-Lys an Lys-to-Arg muhafezekar di du rewşan de hate nirxandin.Wekî kontrolek (neyînî), bermahiyên ku di qada NiRAN ya koronavirus û vîrusên din ên hêlîn de ne an kêm hatine parastin, bi Ala têne guhertin. Li şûna K4116A (di motîfê preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motîf) BN) û D4280A (CN) bi navgîniya nsp12-ê nsp9 NMPylation bi girîngî kêm dike an jî ji holê radike, dema ku proteînên bi veguheztinên muhafezekar (R4178K), K4116R) 60% û 80% ji çalakiya xwe diparêzin, ku ev destnîşan dike ku rihetkirina sînorkirinên li ser milê wan zincîran ji hêla fîzîkî-kîmyayî ve hesas e (Wêne 3D).Veguheztina çend bermahiyên din ên parastî E4145A, D4273A, F4281A û D4283A pir kêmtir zirardar e, û nsp9 UMPylation tenê bi nermî kêm dibe.Encamên bi vî rengî di reaksiyonên nsp9 NMPylasyonê yên ku NTP-yên din jî tê de hene (Wêne 3D û pêveka SI, Figure S3) hatin bidestxistin, piştrast dikin ku bandorên hatine dîtin li ser veguheztinên asîda amînoyî yên taybetî ji celebê hev-substrata nukleotîdê ve girêdayî ne.Dûv re, me bandora gengaz a van veguheztinên nsp12 li ser dubarekirina coronaviruses di çanda hucreyê de ceriband.Ji bo vê armancê, me şablonên guncan ên endezyariya genetîkî yên ADN-ya temamker (cDNA) ku di vîrusa vaccinia ya rekombînant (23, 24) de klonkirî ne, bikar anîn da ku 5 -7 hucreyan veguhezînin.Tîterasyona nifşa vîrusa enfeksiyonê ya ku di van hucreyan de hatî hilberandin destnîşan kir ku piraniya mutantên HCoV-229E NiRAN ne pêkan in (Wêne 3E).Komek mutantên vîrusê yên ne-zirav alternatîfên ku hatine destnîşan kirin ku çalakiya NMP transferase di vitro de ji holê radikin an girîng kêm dikin (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), lê du alternatîfên din hene (K4116R, E4105A) % veqetandî?Çalakiya wan a in vitro NMPylation destnîşan dike ku tixûbên zêde tê de hene.Bi heman rengî, du mutasyonên din (R4178K, F4281A) ku bûn sedema kêmbûnek nerm di çalakiya NMPylasyonê ya in vitro ya NiRAN de vîrusên zindî hilberandin, di heman demê de, van vîrusan bi navgîniya dubarekirinê bi girîngî titrên kêm kirin.Li gorî daneyên çalakiya in vitro ku di Figure 3D de têne xuyang kirin, li şûna çar bermahiyên din ên ku di coronavirus û/an vîrusên din ên hêlînkirî de (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) nehatine parastin, vîrusên zindî hilberandin. Tîterek bi nermî kêm bûye li gorî vîrusa celebê çolê (Wêne 3E).
Ji bo ku were lêkolîn kirin ka çalakiya NMP-transferase ya bi navbeynkariya NiRAN bi qada RdRp-ya çalak ve girêdayî ye, du bermayiyên Asp ên parastî yên ku di koordînasyona îyonên metalê yên duvalent (11) de di motîfa RdRp C de beşdar dibin, ji hêla Ala ve hatin guhertin. Proteîna encam nsp12_DD4823/4AA digire. çalakiya wê ya nsp9 NMPylation, destnîşan dike ku çalakiya nsp9-nsp9 NMPylation di vitro de bi navbeynkariya nsp12 hewcedariya çalakiya polîmerazê nake (Pêvek SI, Figure S4).
Piştî damezrandina çalakiya nsp9-taybetî ya NMP transferase ji bo nsp12, me hewl da ku pêveka NMP-nsp9 ji hêla spektrometriya girseyî (MS) ve diyar bikin.Spectruma girseyî ya proteîna bêkêmasî ya HCoV-229E nsp9 ya rekombînant lûtkeyek li 12,045 Da nîşan da (Wêne 4A).Zêdekirina nsp12 qalîteya nsp9 neguherand, nîşan dide ku nsp12 û nsp9 dê di bin şert û mercên têne bikar anîn de tevliheviyek domdar çênekin (denaturasyon) (Wêne 4A).Di hebûna UTP û GTP de, pîvana girseyê ya reaksiyona ku bi rêzê ve nsp9 û nsp12 tê de heye destnîşan kir ku girseya proteîna UTP 306 Da bar kir, û girseya proteîna GTP 345 Da bar kir, ev destnîşan dike ku her molekulek nsp9 UMP an GMP girêdide. (Wêne 4) C û D).Tê texmîn kirin ku enerjiya ku ji bo nsp9 NMPylation bi navbeynkariya NiRAN-ê hewce dike ji hîdrolîza NTP û berdana pirofosfatê tê.Her çend di vê reaksiyonê de nsp9 (armanc) ji nsp12 (enzîm) 10 qat zêde molarek zêde hate bikar anîn, hema hema bi tevahî NMPylation ya nsp9 hate dîtin, ku destnîşan dike ku têkiliya di navbera nsp12 û nsp9 de kurt e, û nsp12 dikare bêtir nsp9 NMPylate bike. molekula in vitro.
Yekane NMPylasyona nsp9 di hebûna nsp12 û UTP an GTP de.Tîpa girseya proteîna bêkêmasî ya HCoV-229E nsp9 (pêveka SI, Tablo S1) (AD) tê nîşandan.(A) nsp9 tenê, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 di hebûna UTP de, (D) nsp9 + nsp12-His6 di hebûna GTP de.
Ji bo destnîşankirina bermahiyên nsp9 UMPylated ji hêla nsp12 ve, nsp9-UMP bi trypsin ve hate qut kirin.Peptîdên encam bi kromatografiya şilavê ya nano-bi performansa bilind (HPLC) ve hatin veqetandin û ji hêla spektrometriya girseyî ya tandem (MS/MS) serhêl ve hatin analîz kirin.Analîzkirina daneyê bi karanîna pakêta nermalava Byonic (Protein Metrics) UMPylasyona asîda amînî ya N-termînalê nîşan da.Ev bi destan tê pejirandin.Spektrûma girseya hevûdu ya peptîda pêşîn [UMP] NNEIMPGK (pêveka SI, Figure S5A) perçeyek li 421 m/z eşkere kir, ku destnîşan dike ku UMP bi bermayiya 1 ya nsp9 ve girêdide.
Li dawiya N-ya nsp9, Asn di nav endamên Orthocoronavirinae de tê parastin (pêveka SI, Figure S6).Her çend em bawer dikin ku nîtrojena amîneya seretayî ya N-termînalê ji bo UMP-ê ya herî muhtemel qebûlker e, me biryar da ku em delîlên din ên girêdana NMP-ê li N-termînalê bistînin.Ji ber vê yekê, peptîda N-termînalê ya ne-NMPylated û NMPylated nsp9 ku ji hêla HPLC ve hatî paqij kirin di hebûna aceton û sodyûm cyanoborohydride de hate derxistin.Di bin van şert û mercan de, tenê amînên seretayî yên belaş dikarin bi propyl (25) werin guheztin.Peptîda N-termînala nsp9-derketî ya bi rêzika NNEIMPGK du amînên seretayî dihewîne, yek li N-dawiya Asn û ya din jî li zincîra kêlekê ya Lys-ê li dawiya C-yê.Ji ber vê yekê, komên propyl dikarin li her du aliyan bêne destnîşan kirin.Kromatogramên îyonên jêkirî yên peptîdên ne-NMPylated di pêveka SI de, Figure S5B de têne xuyang kirin.Wekî ku tê hêvîkirin, N-termînala û C-termînala (mono)propylated (SI pêvek, Figure S5B, rêça jorîn) û peptîdên dipropylated (SI pêvek, Figure S5B, rêça jêrîn) dikarin bêne nas kirin.Ev nimûne bi karanîna peptîda N-termînalê ya NMPylated ya nsp9 diguhere.Di vê rewşê de, tenê peptîdên C-termînala propylated dikare were nas kirin, lê peptîdên propylated-terminal û peptîdên dipropylated nayên nas kirin (SI Pêvek, Figure S5C), ev nîşan dide ku UMP ji bo amîna seretayî N-termînalê hatiye veguheztin Ji bo pêşîgirtina vê yekê. kom ji çêkirina guhertinan.
Dûv re, em (bi Ala an Ser) diguhezînin an bermahiyên parastî yên li N-termînala nsp9 jê dikin da ku astengiyên taybetî-armanc diyar bikin.Li ser bingeha daneyên meya MS-ê ku destnîşan dike ku NiRAN bi amîna seretayî ya bermayiya N-termînalê ya nsp9 re lêvekek nsp9-NMP çêdike, me hîpotez kir ku nsp9 NMPylation pêdivî bi proteaza sereke ya vîrusê (Mpro, nsp5) heye ku nsp9 N-termînalê ji berde. pêşenga wê ya polyprotein.Ji bo ceribandina vê hîpotezê, me proteînek pêşîn nsp7-11 ku di E. coli de nsp9 heye hilberand û di hebûna [α-32P] UTP (materyal û rêbazan) testek NMPylation standard pêk anî.Wekî ku di Figure 5A de (lane 3) tê xuyang kirin, pêşgira nsp7-11 ya nebirkirî bi nsp12-ê re radyo nayê nîşankirin.Berevajî vê, heke nsp7-11 ji hêla nsp5-ya rekombînant ve were qut kirin da ku nsp9 (û nspsên din) ji pêşgir derxîne, proteînek nîşankirî ya radyoyî ku bi nsp9 re koç dike tê tesbît kirin, ku encama me piştrast dike ku NiRAN û N- Damezrandina Hilbijartî ya pêvekên nsp9-NMP yên kovalent. .Amîna seretayî ya termînalê ya N-termînala Asn (pozîsyona 3825 di pp1a / pp1ab).Ev encam di heman demê de ji hêla ceribandinên ku avakirina nsp9-ê bikar tînin, ku yek an du bermahiyên din li N-terminus-ê vedihewîne, tê piştgirî kirin.Di her du rewşan de, UMPylasyona nsp9-ê bi navbeynkariya NiRAN hate betal kirin (Pêvekek SI, Figure S7).Dûv re, me proteînek bi yek an du bermayiyên Asn-ê yên ku ji rêzika peptîdê 3825-NNEIMPK-3832 li N-termînala nsp9 hatine jêbirin hilberandin.Di her du rewşan de, nsp9 UMPylation bi tevahî hate asteng kirin (Wêne 5B), delîlên din peyda dike ku nsp9 N-terminusa rastîn wekî receptorek NMP tevdigere.
Pêvajoya proteolîtîk a nsp9 û rola bermahiyên N-termînalê di UMPylation bi navbeynkariya nsp12 de.(A) nsp9 UMPylation hewceyê nsp9 N-termînalek belaş hewce dike.Nsp7-11-His6 di 30 °C de di tamponek vedîtina NMPylation de ku UTP heye di hebûn an nebûna Mpro-ya rekombînant (nsp5-His6) de pêş-inkubasyon tê kirin.Piştî 3 demjimêran, bi lê zêdekirina nsp12-His6 wekî ku di Materyal û Rêbazan de hatî destnîşan kirin, ceribandina NMPylation dest pê bikin.Reaksiyona ku nsp5-His6 (lane 1) û nsp9-His6 (lane 2) vedihewîne wekî kontrolek hate bikar anîn.Piştî 10 hûrdeman, reaksiyonê bi dawî bû û tevliheviya reaksiyonê ji hêla SDS-PAGE ve hate veqetandin.Proteîn bi Coomassie Brilliant Blue (A, top) hate reng kirin.Pêşniyara Nsp7-11-His6 û hilbera pêvajoyî ya ku ji perçebûna navbeynkariya nsp5-His6 derdikeve li rastê têne xuyang kirin.Ji kerema xwe bala xwe bidin (ji ber mezinahiya wan a piçûk) ku nsp7 û nsp11-His6 di vê gêlê de nayên tesbît kirin, û reaksiyonê bi nsp5-His6 ve tê dagirtin (rêlên 1 û 4; pozîsyona nsp5-His6 bi dorhêlek hişk tê destnîşan kirin) an jî nsp9-His6 (Lane 2) mîqdarek piçûk a MBP-ê (ji hêla derdorên vekirî ve têne destnîşan kirin) wekî nepaqijiyên bermayî vedihewîne ji ber ku ew wekî proteînên tevhevkirinê yên MBP têne diyar kirin (pêveka SI, Tablo S1).(B) Guhertoya Nsp9-His6 yek an du bermayiyên Asn-ya termînalê tune ye (hejmarkirina bermayî li gorî pozîsyona pp1a / pp1ab) û bi nsp12-His6 û [α-32P] UTP tê paqijkirin û inkubasyon.B, SDS-PAGE ku bi Coomassie ve hatî xêzkirin li jor, B, otoradiografa têkildar li jêr tê xuyang kirin.Cihê nîşankera giraniya molekulî (bi kilodalton) li milê çepê tê xuyang kirin.(C) Bermahiyên parastî yên nsp9-His6 N-termînala HCoV-229E bi Ala an Ser ve hatin guheztin, û heman mîqdara proteîn di reaksiyona UMPylasyonê ya navbeynkariya nsp12-His6 de hate bikar anîn.Berhemên reaksiyonê ji hêla SDS-PAGE ve hatin veqetandin û bi Coomassie Brilliant Blue (C, jor) ve hatin xemilandin, û nsp9-His6-a nîşankirî ya radyoyî ji hêla wênekêşiya fosforesence (C, navîn) ve hate tesbît kirin.Bi karanîna proteîna çolê (wt) wekî referans (ji sedî 100 hatî danîn), çalakiya NMPylasyonê ya têkildar (navînî ± SEM) ji sê ceribandinên serbixwe hate hesibandin.(D) Tîterên vîrusê di supernatantê çanda hucreya p1 ya hucreyên Huh-7 ên ku bi HCoV-229E hucreyên Huh-7-a çolê vegirtî ne, û mutantên ku di nsp9 de veguheztinên asîdên amînî yên destnîşankirî hildigirin bi ceribandina plakê ve hatin destnîşankirin.Motîfa RdRp-kêmbûna dubarekirinê C mutantê ducar DD4823/4AA wekî kontrolek neyînî hate bikar anîn.
N-dawiya nsp9 (bi taybetî pozîsyonên 1, 2, 3, û 6) di nav endamên binmalbata Orthocoronavirinae de pir tê parastin (pêveka SI, Figure S6).Ji bo lêkolîna rola mimkun a van bermayiyan di nsp1-nsp9 NMPylation bi navbeynkariya nsp12 de, du bermahiyên Asn li pey hev li N-dawiya nsp9 bi Ala an Ser (tenê an bi hev re) hatin guheztin.Li gorî nsp9-a celebê çolê, şûna N3825 bi Ala an Ser-ê re ji du qat zêdetir kêmkirina UMPylation-nsp12-ya navbeynkar encam da (Wêne 5C).Li gorî encama me ku NMPylation li şûna zincîra alîgir a bermayiya N-termînalê li amîna seretayî ya N-termînalê pêk tê, me NMPylation mayî ya girîng bi guheztina N3825A û N3825S dît.Balkêş e, ger Asn-ya duyemîn bi Ala an Ser were veguheztin, nsp9 UMPylation bi hêztir kêm dibe (zêdetirî 10 carî), dema ku guheztina Ala li cihên 3, 4, û 6 tenê bandorek nerm li ser nsp9 UMPylation heye (Wêne 2 ) .5C).Encamên bi vî rengî bi karanîna ATP, CTP an GTP (pêveka SI, Figure S8) hatin bidestxistin.Bi hev re, van daneyan rola sereke ya N2826 (pozîsyona 2 di nsp9 de) di nsp9 NMPylation de destnîşan dikin.
Ji bo ku em delîlên pêvek ên pêwendiya fonksiyonel a di navbera N-dawiya nsp9 û NMPylation de bi dest bixin, me rêzek pirjimar (MSA) ya rêzika nsp9 ya malbata Coronavirus (di navbera 104 û 113 bermayiyan de diguhere) pêk anî (Pêvek SI, Figure S6).Bi tevahî, di 47 cureyên (naskirî û gumanbar) de ji 5 cinsên binemalbata Orthocoronavirinae ku mammal, çûk û mêşên cuda dikevin, bi tevahî tenê 8 bermayiyên neguherbar hatine dîtin.Guhertinên herî berfireh, di nav de jêbirin û têxistin, di çerxên di navbera hêmanên avahiya duyemîn a nsp9 de, ku ji hêla lêkolînên strukturî yên berê ve hatine destnîşankirin, hatine dîtin (26 ??28).Pênc bermahiyên guhêrbar di stûna β û helîka α ya beşa C-termînalê ya nsp9 de hatin dîtin.Sê bermayiyên guhêrbar motîfa NNE-ya dawiya N-ya nsp9 pêk tînin.Hat diyar kirin ku Asn-a duyemîn a vê motîfê tenê bermahiya guhêrbar e, ku di heman demê de ji hêla nsp9-a hîpotetîk a coronavirusê beqê ya ji dûr ve têkildar ve tê parve kirin, û celebê Microhyla letovirus 1 di binmalbata Letovirinae ya Alphaletovirus de temsîl dike.Parastina bermayiyan di hêmanên strukturên duyemîn ên nsp9 de dikare ji hêla ramanên strukturel ve were mentiqî kirin da ku taybetmendiyên girêdana ARN-ê yên pêçandî an naskirî biparêzin.Lêbelê, ev sedem ji bo parastina NNE nayê sepandin, û berî vê lêkolînê, cewherê astengiyên ku guheztina rêzika sêpeptîdê sînordar dikin bi tevahî veşartî bû.
Ji bo ku em girîngiya nsp9-NMPylation û parastina NNE di dubarekirina coronavirus de diyar bikin, me mutantên HCoV-229E hilberandin, ku veguheztinên yek an ducar ên bermahiyên nsp9 N-termînalê hildigirin, ku destnîşan dike ku nsp9 NMPylation di vitro de zirardar e.Berî ku em dest pê bikin, em hewl didin ku bersiva vê pirsê bidin gelo ev veguheztin (nêzîkî cîhê veqetandina nsp8 | 9) bandorê li pêvajoya proteolîtîk a herêma C-termînala pp1a dike.Komek avahîyên polîproteîna nsp7-11 ku di nav xala N-dawiya nsp9 de veguheztinên têkildar vedihewîne di E. coli de hate hilberandin û bi Mpro-ya rekombînant hate qut kirin.Parçebûna proteolîtîk a çar deveran (di nav de cîhê alîgirê nsp9) bi girîngî bandor li ti veguheztinên destnîşankirî nayê kirin (pêveka SI, Figure S9), ji bilî guhertinên strukturî yên di van proteînan de ku bi perçebûna nsp8 | 9-ya navbeynkar Mpro-ya navbeynkar asteng dike (An din) malpera.
Xaneyên Huh-7 bi RNA-ya HCoV-229E ya bi dirêjahiya genomê ve hatin veguheztin, veguheztinên Ala an Ser di sêpeptîdên NNE yên parastî (N3825, N3826, û E3827) de li dawiya nsp9 N kod dikin, û destnîşan dike ku piraniya mutasyon kujer in.Me karîbû vîrusê bi şûna Ser an Ala ya N-termînala Asn (N2835A an N2835S) rizgar bikin, lê nekarîn vîrusê bi mutasyonên yek û ducar ên din ên di rêza NNE de vegerînin (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Wêne 5D).
Van encaman destnîşan dikin ku dubarekirina coronaviruses di çanda tevnvîsê de sînordar e (eynî an mîna), mutasyona xwezayî ya malperên nsp9 NMPylation di laş de sînordar dike, û piştgirî dide rola sereke ya vê bersivê di çerxa jiyana koronavirusan de.
Di koma paşîn a ceribandinan de, me C-termînala His6 bi navê SARS-CoV-2 nsp12 û nsp9, û du formên mutant ên nsp12 di E. coli de hilberandin.Bermahiyên malpera çalak di domên NiRAN û RdRp de bi rêzê ve Ala bikar anîn (Şêwira 6A û pêveka SI, Tablo S2).K4465 di SARS-CoV-2 nsp12 de bi K4135-ê di HCoV-229E (Pêvek SI, Xiflteya S2) re têkildar e, ku îsbat kir ku ji bo çalakiya NiRAN û dubarekirina HCoV-229E hewce ye (Wêne 3D û E).Ev bermayî di heman demê de bi bermayiya vîrusa arterial EAV nsp9 K94 re têkildar e, ku berê hate xuyang kirin ku ji bo NiRAN self-UMPylation / self-GMPylation hewce ye (16).Wekî ku di Figure 6B de tê xuyang kirin, SARS-CoV-2 nsp12 xwedan çalakiya UMP transferase ye ku nsp9 wekî substrate bikar tîne, dema ku mutantê malpera çalak nsp12_K4465A neçalak e.Veguheztina ducarî di rêzika taybetmendiya SDD-ê ya motîfa RdRp C de bandorê li çalakiya UMP transferase nake (Wêne 6B), ev destnîşan dike ku çalakiya RdRp di nsp9 UMPylation de bandorek rasterast tune.Daneyên bi vî rengî bi karanîna CTP, GTP û ATP (pêveka SI, Figure S10) hatin bidestxistin.Bi kurtahî, van daneyan destnîşan dikin ku nsp9 NMPylation bi navbeynkariya NiRAN di coronaviruses de çalakiyek muhafezekar heye ku nifşên cûda yên binmalbata ortocoronavirus temsîl dike.
SARS-CoV-2 nsp12-NMPylation of nsp9.(A) Coomassie gêla SDS-polyacrylamide rengkirî ye ku proteîna rekombînant a ku di ceribandina NMPylation de hatî bikar anîn nîşan dide.Wekî kontrolek, proteînek mutant bi veguheztina cîhê çalak di qada NiRAN (K4465A) û qada RdRp (DD5152/3AA) ya SARS-CoV-2 nsp12 de hate bikar anîn.Jimarkirina bermayî li gorî pozîsyona di pp1ab de ye.(B) Autoradiografa vedîtina UMPylation bi karanîna nsp9-His6 û [α-32P]UTP wekî substrate ya nsp12-His6 (cureya çolê [wt] û mutant).Girseya molekulê (bi kilodaltonan) proteîna nîşankirî li milê çepê tê nîşandan.
Domên NiRAN bi gelemperî li Nidovirales têne parastin (16), ev destnîşan dike ku ew reaksiyonên enzîmatîk ên ji bo dubarekirina Nidovirus bingehîn katalîz dikin.Di vê lêkolînê de, me karî îspat bikin ku qada NiRAN ya koronavirusê NMP (ji NTP-ê hatî çêkirin) vediguhêze nsp9, proteînek RNA ya nepenî ya ku di dubarekirina vîrusê de (26 ?? 29 ) ve girêdayî ye, da ku wê wekî armancek xwezayî diyar bike û hevkarê coronavirus RTC.
Domaina NiRAN sê motîfên rêzê (AN, BN, û CN) parve dike, ku hejmareke pir hindik bermayiyên ku di hemî malbatan de di rêza Nidovirales a yekparêz lê pir cihêreng de têne parastin hene (8, 16).Lêkolînên paşîn destnîşan kirin ku ew ji hêla strukturî ve bi malbatek pir bêkêmasî ya proteînên mîna proteîn kinase ve girêdayî ne, ku bi eslê xwe ji malbata SelO re dihat gotin (17, 19, 22, 30, 31).Proteînên girêdayî SelO xwedan pelikên kînasê ne, lê di kînasên klasîk de çend bermahiyên cîhê çalak ên parastî tune ne (22, 32).Li ser bingeha rêgeziya berevajî ya molekulên ATP-ê yên ku bi cîhê çalak ve girêdayî ne û ji hêla danûstendinên taybetî ve têne stabilîzekirin, SelO hate hîpotez kirin û dûv re hate pejirandin ku AMP (li şûna fosfatê) veguhezîne substrata proteînê (22), dema ku proteînek din a bakterî ya mîna SelO-ya YdiU heye. di van demên dawî de hate destnîşan kirin ku girêdana kovalent a UMP bi Tyr û bermahiyên wî yên substratên proteîn ên cihêreng katalîz dike (33).
Ji bo piştrastkirin û berfirehkirina pêşbîniya bermahiyên cîhê çalak ên gumanbar ên domana coronavirus NiRAN, me rêbazên biyokîmyayî û genetîkî yên berevajî bikar anîn da ku analîza mutasyonê li ser coronavirus nsp12 bikin (Wêne 3D û E û SI pêvek, Figure S3 û tablo) S1â. S4).Daneyên destnîşan dikin ku şûna HCoV-229E K4135, R4178 û D4280 bi Ala re çalakiya transferaza NMP-ê ya in vitro û dubarekirina vîrusê di çanda hucreyê de ji holê radike (Wêne 3D û E û pêvekên SI, Figure S3), hebûna wan di NTP γ-fosfatê de piştgirî dike. (K4135, R4178) û hevrêziya îyonên metal ên cîhê çalak (D4280).Veguheztina E4145A ya Gluya parastî ya di nav rêza vîrusa hêlîna çûkan de ku tê pêşbînîkirin ku pozîsyona K4135 (17) aram bike, hate destnîşan kirin ku dubarekirina vîrusê ji holê rabike, lê ecêb e, çalakî di ceribandina NMPylation in vitro de hate ragirtin (Wêne 3D û E û Pêveka SI, Figure S3 Û Tabloyên S1-S4).Dema ku veguheztina têkildar di homologa YdiU ya Salmonella typhimurium (E130A) de (33) de çavdêriyek wusa hate kirin.Bi hev re, van daneyan li şûna fonksiyona katalîtîk fonksiyona birêkûpêk a vê bermahiya parastî piştgirî dikin.
Veguheztina bermayiya Phe ya parastî (F4281A) di nav rêza nestovirus de di qada HCoV-229E NiRAN (8) de bû sedema kêmbûna çalakiya NMPylation di vitro de û kêmbûnek girîng a dubarekirina vîrusê di çanda hucreyê de (Wêne 3D, E û SI) pêvek, Figure S3).Daneyên bi fonksiyona rêziknameyê ya girîng a vê bermayîyê re hevaheng e, wek mînak motîfa homolog a DFG bermahiyên Phe ku berê hatî destnîşan kirin.Di proteîn kînasên klasîk de, ew beşek ji girêka girêdana Mg2+ ye û ji berhevkirin û birêkûpêkkirina stûnê dibe alîkar???Ji bo çalakiya katalîtîk a bandorker hewce ye (32, 34).Cîgirkirina Ala û Arg ji bo bermayiyên K4116 (di motîfa preAN de), bi rêzê ve, vejandina vîrusê ji holê rakir û, wekî ku tê hêvî kirin, bandorên cihêreng li ser çalakiya NMP transferase di vitro de hebû, li gorî zincîra alîgirê amînoasîdê ku hatî destnîşan kirin (Pêvekên 3D Û E û SI). , Wêne S3).Daneyên fonksiyonel bi agahdariya strukturel re hevaheng e, ku destnîşan dike ku vê bermayî bi fosfatê ATP re têkiliyek saz kiriye (17).Di domana NiRAN a malbatên vîrusên hêlînkirî yên din de, pozîsyona HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ji hêla Lys, Arg an His (8) ve tê dagir kirin, ev destnîşan dike ku sînorkirina fonksiyonê ya vê bermayiya taybetî rehet bûye.Cîgirkirina D4188A û D4283A çalakiya enzîmê ji holê radike an bi xurtî kêm dike û dubarekirina vîrusê ji holê radike (Wêne 3).Van her du bermayiyan di piraniya (lê ne hemî) vîrusên hêlîn de têne parastin (8), ku fonksiyonek girîng a malbatê lê dibe ku ne-katalîtîk destnîşan dike.Veguheztinên Ala yên çend bermahiyên Lys û Asp yên din (K4113A, D4180A, D4197A û D4273A) ku di Coronaviridae an malbatên din ên Nestioviridae de ne hatine parastin (8) wekî kontrol hatine bikar anîn.Wekî ku tê çaverê kirin, ev veguheztin bi piranî tolerans in, bi kêmbûnek sivik di çalakiya enzîmê de û di hin rewşan de dubarekirina vîrusê (Wêne 3 û pêveka SI, Figure S3).Bi tevayî, daneyên mutagenesisa coronavirus bi xwe-GMP û daneyên genetîkî yên berevajîkirî yên EAV NiRAN-RdRp (16) re pir hevaheng e, ku tê de EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) K94 (bi HCoV-229E K4135 re têkildar) fonksiyonên girîng digire), R124 (bi R4178 re têkildar), D132 (bi D4188 re têkildar), D165 (bi D4280 re têkildar), F166 (girêdayî F4281).Wekî din, daneyên mutagenesisa HCoV-229E bi daneyên genetîka berevajîkirî yên SARS-CoV-ê yên ku berê hatine ragihandin (16) re hevaheng e û berfirehtir e, bi heman rengî pir dişibihe yên ku ji bo motîfa CN ya têkildar Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 hatine dîtin. fenotîpa diyarkirî -F219A û HCoV-229E_F4281A (Wêne 3 D û E û pêveka SI, Figure S3 û Tablo S1-S4).
Li gorî ortolojên EAV (16), ku ji bo UTP û GTP (di berteka xwe-NMPylation de) tercîhek zelal e, lêkolîna me destnîşan dike ku domaina coronavirus NiRAN (ji hêla HCoV-229E û SARS-CoV-2 ve hatî temsîl kirin) dikare bi bandor be. Her çar NMP hatine veguheztin, her çend ji bo UMP tercîhek sivik heye (Wêneyên 1 û 3).Taybetmendiya nisbeten kêm a hev-substrateya taybetî ya NTP-ê bi avahiyek superkompozîtê ya SARS-CoV-2 ya vê dawiyê hatî ragihandin re hevaheng e, ku tê de ADP-Mg2+ bi malpera çalak a NiRAN ve girêdide, lê ne bi Parçeya adenîn re. ji pêkhatina têkiliyên taybet (17).Di lêkolîna me de, celebê nukleotîdê ku di reaksiyona NMPylasyonê de tê bikar anîn li ser çalakiya proteîna mutant (SI Pêvek, Figure S3) ti bandorek cihêreng nîne, ku destnîşan dike ku yek ji van bermayiyan ji nêz ve bi girêdana navokek taybetî re têkildar nîne.Bingeha strukturî û girîngiya biyolojîkî ya potansiyel a vebijarkên cihêreng ên hev-substratê yên NTP-ê yên ku di domên NiRAN yên coronavirus û vîrusên arterial de têne dîtin têne lêkolîn kirin;dibe ku ew rast bin an jî dibe ku ji ber sînorên lêkolînên wan ên têkildar bin.Heya nuha, nekare were derxistin ku çalakiya potansiyel a NMPylator ya virusa arterial domaina NiRAN (li gorî çalakiya xwe-NMPylation ya berê hatî destnîşan kirin) xwedan tercîhek hev-substratê ya cihê ye, lewra ku wekheviya di navbera arterial û coronavirus de tê hesibandin. Domaina NiRAN di sînorê xwe de ye.Rêz-bingeha Compare (16).Li gorî pseudokinase SelO, ku Mg2+ wekî kofaktorek bikar tîne, çalakiya coronavirus û vîrusa arterialî NiRAN bi Mn2+ ve girêdayî ye (16) (Şîfre 3C û pêveka SI, Figure S1).Girêdana Mn2+ û tercîha eşkere ya ji bo UTP taybetmendiyek neasayî ya NMPylatorên proteîn e, û tenê vê dawiyê di proteîna YdiU ya Salmonella typhimurium de hate pejirandin, ku ew UMPylation chaperone proteîna hişk a girêdayî Mn2+ katalîz dike da ku hucreyan ji înduksiyona stresê biparêze Pool ATP hucreyê. 33).
Wekheviya avahîsaziya vê dawiyê ya ku di navbera domana coronavirus NiRAN û proteîna kînazên hucreyî de hatî diyar kirin (17, 19) ji bo şiyana NiRAN-ê ku NMP-ya kovalentî bi proteînên din ên ku me di vê lêkolînê de ragihandine ve girêdide, piştgirî dide.Me lêgerîna xwe ya ji bo armancên gengaz ên NiRAN li ser proteînên ku ji hêla HCoV-229E ORF1a ve hatî kod kirin, ku têne zanîn ku rasterast an nerasterast arîkariya replikasa kodkirî ya ORF1b ya RTC dikin, kir (12, 35).Ceribandinên me ji bo NMPylasyona bi bandor û taybetî ya nsp9 delîlên berbiçav peyda dikin (Wêne 2).Ger proteîna armanc di zêdebûnek molar de ku 8 û 10 carî ji ya enzîmê (nsp12) bilindtir e were bikar anîn, tê pejirandin ku nsp9 bi tevahî (mono)NMPkirî ye (Wêne 4).Me encam da ku danûstendina di navbera nsp12 û nsp9 de kurt e û dê bi nsp9 re tevliheviyek domdar çê neke (di nebûna beşên din ên RTC de).Ev encam ji hêla lêkolînên danûstendina proteîn li ser proteoma SARS-CoV ve tê piştgirî kirin (35).Analîza MS amîna seretayî ya bermayiya N-termînalê ya nsp9 wekî cîhê NMPylation nas kir (pêveka SI, Figure S5).Damezrandina girêdana fosforamidat û koma amînî ya N-termînalê çalakiya NMPylation bi navbeynkariya NiRAN ji reaksiyona AMPylasyonê ya bi navbeynkariya Pseudomonas syringae vediqetîne, ku avakirina AMP-ya-girêdayî li Ser, Thr, an Tyr bermahiyên peptîdê katalîze dike. 22), û S. typhimurium YdiU bi O-girêdayî (bi Tyr) û N-girêdayî (bi Wî) peptîd-UMP-ê zêde dike.Agahdariya tixûbdar a ku li ser malbata proteînan SelO heye destnîşan dike ku endamên vê malbata proteîn a mezin di avakirina peptîd-NMP de pir cûda dibin.Ev çavdêriyek balkêş e ku hêjayî lêkolînê ye.
Daneyên ku di vê lêkolînê de hatine wergirtin me rê da ku em hîpotez bikin ku NMPylation ya nsp9 hewceyê N-dawiyek belaş hewce dike.Di çarçoweya dubarekirina vîrusê de, ev ê ji hêla veqetandina proteolîtîk a cîhê pêvajoyê nsp8 | nsp9 ve di polîproteîna replicase pp1a de ku ji hêla Mpro û pp1ab ve tê navbeynkirin, were peyda kirin.Di piraniya coronavirusan de, ferqa di navbera vê malpera taybetî (VKLQ|NNEI li HCoV-229E) û hemî malperên perçekirina coronavirus Mpro-ya din Asn e (li şûna bermahiyek piçûkek din, wek Ala, Ser An Gly) P1â dagir dike???Cih (36).Daneyên qutkirina peptîdê ku di lêkolînên destpêkê de hatine bidestxistin destnîşan kir ku karbidestiya perçebûnê ya malpera nsp8|nsp9 ji ya malperên din kêmtir bû, û destnîşan dike ku 1) ev cîhê taybetî dibe ku di pêvajoya hevrêziya biwext a C-termînalê de xwedî rolek rêkûpêk be. Herêma pp1a, an 2) a Rola nsp9 N-dawiya taybetî ya parastî di dubarekirina vîrusê de (37).Daneyên me (Wêne 5A) destnîşan kir ku forma rekombînant a nsp9 ku rêzika N-termînalê ya rastîn hildigire ji hêla nsp12 ve bi bandor NMP hate çêkirin.Rêzeya alîgirê N-termînalê ji hêla faktora Xa (nsp9-His6; pêveka SI, Tablo S1) an veqetandina Mpro-navbeynkar (nsp7-11-His6; Figure 5A û pêveka SI, Tablo S1) hate rakirin.Ya girîng, nsp7-11-His6-a nebirrînkirî ya ku pêşnumaya nsp7-11-His6 li hember NMPylation ya nsp12-ê, ku bi daneyên me re hevaheng e, berxwedanek nîşan da, û destnîşan dike ku pêveka nsp9-NMP bi navgîniya amîna seretayî ya N-termînalê pêk tê (pêveka SI, Figure S5) .Ji bo ku em têgihiştinek kûr a taybetmendiya substratê NiRAN bistînin, me dûv re bal kişand ser bermahiyên N-termînala cîran a nsp9.Di nebûna proteînên din de, ew ji hêla strukturî ve maqûl in, nahêlin ku ew di forma nenavkirî ya nsp9 (26 28, 38) de werin tesbît kirin, cihêrengiya wan a xwezayî ya tixûbdar nîşan dide. fonksiyona perçeya nsp9 N-termînalê.Veguheztinên Ala yên bermahiyên parastî yên li vê herêmê (Wêne 5C û D û pêveka SI, Figure S8) diyar dike ku N3826 ji bo nsp9 NMPylation in vitro bingehîn e, dema ku veguheztinên N3825A û E3827A rê li kêmbûna NMPylation vedike, dema ku cîgirkirina M3829A û P38 ne. .Zelal bandorê li nsp9 NMPylation dike.Her çend veguheztina Asn-ya termînalê (N3825A, N3825S) tenê bandorek nerm li ser nsp9 NMPylation û dubarekirina vîrusê di çanda şaneyê de heye (Wêne 5C û D), jêbirina rêzek bermayî ya Asn ji dipeptîda N-termînala 3825-NN îsbat kir ku ew ji vîrusan re kujer e, ev destnîşan dike ku bermayek Asn berî bermayîyek din li dawiya N-yê, bi tercîhî Asn, hewce ye, her çend xuya ye ku cîgirkirina bermahiyên wekhev dikare bi qismî were tolerans kirin (Wêne 5B, C, û D).Em encam didin ku dipeptîda 3825-NN, nemaze bermayiya N3826 ya parastî û bingehîn a di nav rêza coronavirus de (pêveka SI, Figure S6), girêdan û rêgezkirina rast a nsp9 N-dawiya li cîhê çalak a NiRAN misoger dike.
Cîgirkirina Ala (E3827A) ji bo Glu-ya parastî ya hemî binmalbatan nsp9 NMPylation di vitro de digire, lê ji vîrusên di çanda şaneyê de kujer e (Wêne 5C û D), fonksiyona zêde ya vê bermayîyê nîşan dide, mînakî, di danûstendinên sereke de (NMPylated an neguhêrbar). ) nsp9 N-terminus û faktorên din ên ku di dubarekirina vîrusê de têkildar in.Mutasyonên Nsp9 bandor li pêvajoya proteolîtîk a nsp9 an jî ti nspsên cîran nekir (39) (Pêvek SI, Figure S9), ev destnîşan dike ku fenotîpên kujer ên gelek mutasyonên nsp9 yên hatine dîtin ji ber nerêkûpêkkirina devera C-proteolîtîk-termînala pp1a ne bûne sedema .
Daneyên jorîn delîl peyda dikin ku piştî dermankirina Mpro-navbeynkar a cîhê veqetandina nsp8 | 9 li pp1a / pp1ab, N-dawiya nsp9 dikare UMPylated bibe (an jî qismî bi NMP-ya din re were guheztin).Wekî din, parastina hêja ya N-termînala nsp9 (di nav de bermahiyên Asn-ê yên yekalî û guhezbar ên di malbata coronavirus de jî tê de) û daneyên genetîkî yên berevajî yên ku di vê lêkolînê de hatine bidestxistin (Wêne 3E û 5D) me hişt ku em encamê bidin ku nsp9 NMPylation ji hêla biyolojîkî ve girêdayî ye û ji bo dubarekirina coronavirus pêdivî ye.Encamên fonksîyonel ên vê guheztinê hîna têne lêkolîn kirin, mînakî, di derbarê çalakiya girêdana RNA ya nsp9 (forma ne-guhêrbar) ya berê hatî şirove kirin (2628).NMPylasyona N-termînalê jî dibe ku bandorê li pêwendiya nsp9 bi proteîn an substratên RNA an damezrandina meclîsên çar-astî yên cihêreng bike.Vana di lêkolînên binesaziyê de hatine dîtin û hatine pejirandin ku bi fonksiyonelkî bi dubarekirina coronavirus ve girêdayî ne, her çend nemaze di nebûna Di doza vê guheztinê de (26- ââ29, 40).
Her çend taybetmendiya armancê ya domana coronavirus NiRAN hîn jî pêdivî ye ku bi hûrgulî were destnîşan kirin, daneyên me destnîşan dikin ku taybetmendiya hedefa proteîn a domaina coronavirus NiRAN pir teng e.Her çend parastina bermahiyên malpera çalak a sereke (8, 16) di qada NiRAN de ya hemî malbatên nidovirus bi xurtî piştgirî dide çalakiya van proteînan NMPylatorê parastî, nasnameya bermahiyên pocket girêdayê substratê yên vê domanê Parastin û parastin dimîne ku were destnîşan kirin. , û dibe ku di navbera malbatên cihêreng ên armancên Nidovirales de cûda bibe.Bi heman rengî, armancên têkildar ên vîrusên hêlîn ên din hêj nehatine destnîşankirin.Dibe ku ew ortolojên dûr ên nsp9 an proteînên din bin, ji ber ku rêzikên li derveyî pênc qadên replicase yên ku bi gelemperî di vîrusên hêlînê de têne parastin kêmtir têne parastin (8), di nav wan de rêza genomê ya di navbera Mpro û NiRAN de, di nav wan de, nsp9 di vîrusa koronayê.
Wekî din, em aniha nekarin îhtîmala ku domaina NiRAN xwedan armancên zêde (tevî hucreyî) derxînin holê.Di vê rewşê de, hêjayî gotinê ye ku homologên bakterî yên di vê proteîna NMPylators (NMPylators) (30, 31) de xuya dikin ku xwedan "rêveberên sereke" ne?NMP cûrbecûr proteînên hucreyî modul dike da ku çalakiyên wan ên jêrîn birêkûpêk an jêbirin, bi vî rengî di cûrbecûr pêvajoyên biyolojîkî de, wekî bersiva stresa hucreyî û homeostasis redox (22, 33) rolek dileyize (22, 33).
Di vê lêkolînê de (Wêne 2 û 4 û Pêveka SI, Wêneyên S3 û S5), me karîbû îspat bikin ku nsp12 beşa UMP (NMP) veguhezand cîhek yekane (parastî) di nsp9 de, dema ku proteînên din di nsp9 de nehatin guheztin. Di bin şert û mercan de tê bikar anîn, taybetmendiya substratê ya baş-dîyarkirî (ji dêlva berz) tê piştgirî kirin.Bi vê yekê re hevaheng, li gorî NMPylasyona N-termînalê ya nsp9, çalakiya NMPylation ya xweya nsp12 pir kêm e, vedîtina wê demek dirêjtir xuyangkirina otoradiyografî hewce dike, û zêdebûnek 10-qatî di giraniya nsp12 de tê bikar anîn.Wekî din, analîza meya MS-ê ji bo NMPylation ya nsp12 delîl peyda nekir, ku pêşniyar dike ku xwe-NMPylation domainê NiRAN (bi çêtirîn) çalakiyek duyemîn e.Lêbelê, divê were zanîn ku lêkolînên din delîlên pêşîn peyda kirine ku statûya xwe-AMPylation ya NMPylatorê bakterî dikare çalakiya wan a NMPylation li ser substratên proteîn ên din kontrol bike (22, 33).Ji ber vê yekê, ji bo vekolîna bandorên fonksiyonel ên gengaz ên çalakiyên xwe-NMPylasyonê yên ku ji bo EAV nsp9 (16) û coronavirus nsp12 (vê lêkolînê) hatine ragihandin, bêtir lêkolîn hewce ye, tevî bandora chaperone-ya pêşniyarkirî ya li ser pêçandina qada RdRp ya C-termînalê ( 16)).
Berê, gelek hîpotezên di derbarê fonksiyonên jêrîn ên mimkun ên qada nidoviral NiRAN de hatine hesibandin, di nav de RNA ligase, RNA-sergirtî guanylate transferase û çalakiya pêşîn a proteînê (16), lê yek ji wan bi fonksiyonên jêrîn ên berdest re hevaheng in.Agahiyên ku di pozîsyonên jêrîn de têne wergirtin tam di heman demê de bêyî ku texmînên zêde bikin.Daneyên ku di vê lêkolînê de hatine bidestxistin herî zêde bi (lê nikare îsbat bike) ku qada NiRAN di destpêkirina senteza RNA-yê ya proteîn de têkildar e.Berê dihat bawer kirin ku fonksiyona domaina NiRAN di 5??Berhevkirina ²-RNA an reaksiyonên girêdana RNA ji van û Piştgiriya daneyên din nayê bandor kirin.Ji ber vê yekê, mînakî, malpera çalak a NiRAN tê hesibandin ku Asp-ya parastî wekî bingehek giştî tê de heye (D252 di Pseudomonas syringae SelO; D4271 di HCoV-229E pp1ab; D208 di SARS-CoV-2 nsp12 de) (Pêvek SI, wêne 2 ).S2) (17, 22, 33), dema ku katalîzasyona di lîgaza RNA-ya girêdayî ATP û enzîma vegirtinê ya RNA de ji hêla enzîma kovalent-(lysyl-N)-NMP ve tête kirin, ku tê de bermayîyek Lys-a ne-Guherîn pêk tê ( 41).Wekî din, taybetmendiya berbiçav a li ser bingeha rêzê ya coronavirus NiRAN ji bo armancên proteîn ên parastî û taybetmendiya rehet a ji bo hev-substratên NTP (UTP tercîh dike) li dijî fonksiyonên enzîma girtinê ya bi navbeynkariya NiRAN an RNA-lîgaze-yê ye.
Eşkere ye, ji bo verastkirin û, ger were îsbat kirin, li ser rola muhtemel a nsp9-UMP (nsp9-NMP) di senteza RNA-yê ya proteîn-hilberandî de, gelek xebatek zêde hewce dike ku were verast kirin û, heke were îsbat kirin, ku dê çend raporên balkêş lê (heta nuha) yên ku berê hatine ragihandin girêbide. .Çavdêriyên îzolekirî.Mînakî, hate destnîşankirin ku dawiya RNA-ya negatîf a coronavirus bi zincîrek oligo(U) dest pê dike (42, 43).Ev çavdêrî bi vê ramanê re hevaheng e ku senteza RNA-ya negatîf bi girêdana forma UMPylated a nsp9 bi dûvika polî(A) ve (teqandin) ve tê destpêkirin, ku dibe ku bi girêdana wê ya RNA-yê ve were pêşve xistin. proteînek din a RTC.Dûv re beşa UMP ya ku ji hêla nsp9 ve hatî peyda kirin dikare wekî "primer" ji bo oligouridylation bi navbeynkar nsp7/8/nsp12 were bikar anîn, bi karanîna dûvika 3??²-poly(A) di RNA genomîk an rêzek din a oligo (A) de tê de heye. wekî şablonek kar dike, mîna mekanîzmaya ku ji bo proteîna VPg ya picornavirus hatî damezrandin (44).Heke pêşniyar "ne-normative" be????Destpêkirina senteza RNA-ya negatîf (ji proteînê) girêdanek bi çavdêriyan re peyda dike, û destnîşan dike ku RNA-ya negatîf a coronavirus di dawiya xwe de UMP (li şûna UTP) heye (42), ku tê hesibandin ku destnîşan dike ku asîda nukleîk Dicer dawiya fosforîlekirî ji hêla endonukleazek taybetî-uridine nenas vediqetîne.Ger were pejirandin, ev çalakiya hîdrolîtîk a asîda nukleîk dikare bibe alîkar ku forma oligomerîkî ya UMPylated a nsp9 ji dawiya 5² ya zincîra neyînî ya nûbûyî azad bike.Rola muhtemel a nsp9 di destpêka proteînê de di heman demê de bi lêkolînên genetîkî yên berevajî yên berê re jî hevaheng e, ku destnîşan kir ku nsp9 (û nsp8) bi krîtîk û bi taybetî bi hêmana RNA-ya cis-çalakkirî ya parastî ya nêzî dawiya 3-ê ya genoma coronavirus re têkildar e.45).Li gorî vê raporê, ev çavdêriyên berê niha dikarin bi lêkolînên din ji nû ve werin vekolîn û berfireh kirin.
Bi kurtahî, daneyên me çalakiya taybetî ya etîketa enzîma vîrusê ya xwedan hêlîn a ku bi RdRp-ê li N-termînalê ve girêdayî ye diyar kir.Di coronavirus de, ev çalakiya UMPylator/NMPylator-a ku ji nû ve hatî vedîtin bi navbeynkariya NiRAN-ê tê bikar anîn da ku xwe bispêre Mn2+ û bermahiyên Asn ên cîran û dibe sedema avakirina girêdanên fosforamîdate (kêm-enerjî) bi amîna seretayî ya N-termînalê.Bi navbeynkariya Mpro-ya navbeynkar li cîhê veqetandina nsp8|9, armanca nsp9 dikare ji bo NMPylation were bikar anîn, ku hevgirtina fonksiyonel a di navbera protease û qada NiRAN de, ku heya RdRp dirêj dibe, destnîşan dike.Parastina bermahiyên sereke yên di malpera çalak a nsp12 NiRAN û hedefa nsp9 de, digel daneyên ku ji du coronavirusên ku SARS-CoV-2 jî di nav de hatine bidestxistin, delîlên xurt peyda dike ku nsp9 NMPylation koronavirusek e Taybetmendiyên muhafezekar di heman demê de di dubarekirina vîrusê de gavek bingehîn in.Daneyên berdest me rê li ber vê yekê digirin ku rola taybetî ya forma NMPylated a nsp9 di senteza RNA-ya ku ji proteîn ve hatî çêkirin de senaryoyek maqûl e ji bo coronavirus û vîrusên din ên hêlînkirî, û dibe ku NiRAN proteînên din ên nenas jî bike hedef.Vîrusê birêkûpêk bikin.Têkiliya mêvandar.Ger were pejirandin, tevlêbûna primerên proteînê di senteza RNA ya vîrusê de dê girêdana rêzê ya domên Mpro/3CLpro û RdRp di navbera coronavirusê ku berê hatî tespît kirin û superkoma mîna picornavirus (9) de zêde bike, yên ku naha di Pisoniviritesên nû hatine damezrandin de hatine yek kirin. 46) di kategoriyê de.
Daneyên me her weha destnîşan dikin ku çalakiyên enzîmê yên bingehîn, bijartî û muhafezekar ên ku di vê lêkolînê de hatine destnîşan kirin dikarin wekî armancên dermanên antiviral werin bikar anîn.Pêkhateyên ku di girêdana (û guheztina paşîn) ya nsp9 N-dawiya parastî ya li cîhê çalak a NiRAN de asteng dikin, dikarin bibin dermanên antîvîrûs ên bi bandor û pirreng, yên ku ji bo dermankirina coronavirusên heywanan û mirovan ên ji enfeksiyonên (bin) cûrbecûr guncan in. , di nav de SARS-CoV-2 û Syndroma Respiratory ya Rojhilata Navîn Coronavirus.
Rêzeya kodkirinê ya proteîna coronavirus ku di vê lêkolînê de hatî hilberandin ji hêla RT-PCR ve bi karanîna RNA-ya ku ji Huh-7 vegirtî bi HCoV-229E an Vero E6 vegirtî bi SARS-CoV-2 ve hatî vegirtin, hate zêdekirin û bi karanîna prosedurên klonkirina standard ve hatî danîn.pMAL-c2 (Laboratoriya Biyolojîk a Nû Îngilîstanê) an vektora vegotinê ya pASK3-Ub-CHis6 (47) (Pêveka SI, Tabloyên S1 û S2).Veguheztinên yekane yên kodonê ji hêla mutagenesis-rêvebiriya malperê ve-based PCR-ê ve hatî destnîşan kirin (48).Ji bo hilberîna proteîna tevhevkirinê ya MBP, şaneyên E. coli TB1 bi avahiyek plasmîdê ya pMAL-c2 ya guncan ve hatin guheztin (pêveka SI, Tablo S1).Proteîna fusionê bi kromatografiya pêwendiya amîlozê hate paqij kirin û bi faktora Xa ve hate qut kirin.Dûv re, proteîna C-termînala His6-tagged ji hêla kromatografiya pêwendiya metalê ya Ni-bêçalakkirî (Ni-IMAC) ve hate paqij kirin (49).Ji bo hilberîna proteîna fusion a ubiquitin, şaneyên E. coli TB1 avahiya plasmîdê ya pASK3-Ub-CHis6 ya maqûl (SI Pêvek, Tabloyên S1 û S2) û DNA-ya plazmida pCGI ya ku hîdrolasa C-termînala-taybetî ya ubiquitin 1 (Ubp1) kod dike bikar anîn.Veguherîn (47).Proteîna koronavirusê ya C-termînalê His6-ê wekî ku berê hatî destnîşan kirin hate paqij kirin (50).
Testa xwe-NMPylasyonê ya HCoV-229E nsp12-His6 wekî ku di EAV nsp9 (16) de hatî destnîşan kirin hate kirin.Bi kurtasî, nsp12-His6 (0,5 μM) 50 mM 4-(2-hîdroksîethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 μM buffer heye. NTP-ya diyarkirî û 0,17 μM li hev [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) li 30 °C ji bo 30 hûrdeman.Di hemî ceribandinên NMPylasyonê yên din (standard) yên nsp12-navbeynkariya nsp9 NMPylation de, şert û mercên reaksiyonê wiha têne sererast kirin: nsp12-His6 (0,05 μM) û nsp9-His6 (4 μM) di hebûna 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 μM NTP nîşan dan, û 0,17 μM hev [α32-P]NTP.Piştî ku 10 hûrdeman li 30 °C înkubat kirin, nimûneya reaksiyonê bi tampona nimûneya SDS-PAGE re hate tevlihev kirin: 62,5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glycerol û 0,0005% bromophenol. şîn.Proteîn bi germkirina li 90 °C ji bo 5 hûrdeman hate denaturîzekirin û ji hêla 12% SDS-PAGE ve hate veqetandin.Gel bi çareseriya Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% asîta acetîk, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250) tê sabîtkirin û reng kirin, reng tê dereng kirin, û 20 demjimêran li ber ekranek wênekêşiya fosforesent tê rijandin (ji bo ku nsp12 ji NMPylasyonê were tespît kirin) an (herî zêde) 2 Saet (ji bo nirxandina nsp9 NMPylation).Wêneyek Typhoon 9200 (GE Healthcare) ji bo şopandina dîmenderê û ImageJ ji bo analîzkirina tundiya sînyalê hate bikar anîn.
Ji bo analîza MS-ê, 1 μM nsp12-His6 û 10 μM nsp9 (bêyî nîşana hexahistidine) di analîza NMPylation de (pêveka SI, Tablo S1) hatin bikar anîn û zêdebûna giraniya 500 μM UTP û GTP hate bikar anîn.Li gorî konsantasyona wan û kalîteya proteîna çaverêkirî, pergalek HPLC ya Waters ACQUITY H-Class ku bi stûnek MassPrep (Waters) ve girêdayî ye ji bo şorkirina 1 heya 10 µL ji çareseriyên proteîna tampon serhêl hate bikar anîn.Proteîna şorkirî di nav çavkaniya îyona elektrosprayê ya Synapt G2Si spectrometer (Av) de bi navgîniya jêrîn a tampon A (av / 0,05% asîdê formîk) û tampon B (acetonitrile / 0,045% asîdê formîk) tê avêtin, û germahiya stûnê ye. 60 ° C û rêjeya herikîna 0,1 mL/min: 2 hûrdeman bi 5% A bi isokratîk şuştin, dûv re di nav 8 hûrdeman de pileyek rêzik heya 95% B, û 4 hûrdemên din 95% B biparêzin.
Îyonên erênî yên bi girseya 500 heta 5000 m/z têne dîtin.Glu-fibrinopeptide B her 45 saniyeyan carekê ji bo sererastkirina barkêşiya girseyî ya otomatîkî tê pîvandin.Nermalava amûrê MassLynx bi dirêjkirina MaxEnt1 bikar bînin da ku spektra navîn piştî derxistina bingehîn û nermkirinê veqetînin.
UMPylated HCoV-229E nsp9 bi lêzêdekirina trîpsîn (Serva) ya guhertî ya bi pola rêzkirinê ve hate vejandin û bi şev di 37 °C de hate înkubakirin.Stûnek spinê ya Chromabond C18WP (hejmara beşê 730522; Macherey-Nagel) hate bikar anîn da ku peptîdan şor bikin û berhev bikin.Di dawiyê de, peptîd di 25 µL avê de, ku 5% acetonitrile û 0.1% asîda formîk tê de, hate hilweşandin.
Nimûne ji hêla MS ve bi karanîna spektrometerek girseyî ya Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific) ve hatî analîz kirin.Pergala paşîn a nanoâ HPLC (Dionex), ku bi dawiya xwerû ya 50 cm ve hatî çêkirin?Stûna 75 μm C18 RP ya ku bi 2,4 μm mûçikên magnetîkî ve hatî pak kirin (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Bi çavkaniya nanospray Proxeon ve bi spektrometera girseyî ya serhêl ve girêdin;6 µL çareseriya helandinê ya trîpsînê derzînin nav 300 μm pîvaza hundurîn ×??1 cm C18 PepMap stûna pêş-konsantrekirinê (Thermo Scientific).Bi karanîna av / 0,05% asîda formîk wekî çareserker, nimûne bixweber hate girtin û bi leza herikîna 6 µL/min hate şorkirin.
Rêjeyên jêrîn ên av / 0,05% asîdê formîk (çarê A) û 80% acetonitrile / 0,045% asîdê formîk (çareser B) hatin bikar anîn da ku veqetandina peptîdên trîptîkî bi rêjeya herikîna 300 nL/min: 4% B ji bo 5 hûrdeman, dûv re 30 A gradienta xêzik heya 45% B di nav çend hûrdeman de, û zêdebûnek xêzkirî heya 95% çareserkar B di nav 5 hûrdeman de.Stûna kromatografiyê bi nano-emîterek pola zengarnegir (Proxeon) ve girêdin, û eluentê rasterast bi kapilaya germkirî ya spektrometera girseyî bi karanîna potansiyela 2,300 V re birijînin. Di analîza girseyî ya Orbitrapê de skankirina anketê bi çareseriya 60,000 re têkildar e. bi kêmî ve sê şaneyên MS/MS-ê yên daneyê, bi dînamîk ji bo 30 çirkeyan veqetandî, bi karanîna veqetandina veqetandina xefika îyonê ya xêzkirî an veqetandina pevçûna enerjiyê ya bilindtir ku bi vedîtina orbitrapê re têkildar e, çareserî 7,500 e.
Dema şandinê: Tebax-03-2021